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技术资源蛋白表达专题蛋白表达常用试剂/缓冲液配置

蛋白表达常用培养基及缓冲液配置

蛋白表达常用培养基

TB培养基配置

Tryptone 7.2g，yeast 14.4g，甘油3g，磷酸氢二钾9.86g，磷酸二氢钾1.4g，去离子水搅拌溶解，定容至600ml（可分装成两瓶使用），其他量依次放大；

LB液体培养基配置

Tryptone 1g，yeast 6g，氯化钠1g，去离子水溶解搅拌，定容至100ml；其他量依次放大；
固体LB培养基，按照1.5%的量加入琼脂

2xYT培养基配置

Tryptone 9.6g，yeast 6g，氯化钠3g，去离子水搅拌溶解后定容至600ml；其他量依次放大；

MD选择培养基配置

在80ml的去离子水中加入2g琼脂糖，120度灭菌20min，温度下降60℃之后，超净台加入10ml 10xYNB（13.4g/L），10ml的10x葡萄糖（20g/L），0.2ml的500x生物素（4×10-4g/L）；

MM选择培养基配置

在90ml的去离子水中加入2g琼脂糖（20g/L），120度灭菌20min，温度下降60℃之后，超净台加入10ml 10xYNB（13.4g/L），0.2ml的500x生物素（4×10-4g/L），0.5ml甲醇（0.5%）；

10xYNB配置

134gYNB固体溶于1L的去离子水中，过滤灭菌，4℃保存；

YPD完全培养基

Tryptone 20g/L，yeast 10g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基添加1.5%的琼脂；

RDB转化培养基配置

山梨醇186g/L，琼脂糖20g/L，120度灭菌20min，温度下降60℃之后，超净台加入10ml 10xYNB（13.4g/L），10ml的10x葡萄糖（20g/L），0.2ml的500x生物素（4×10-4g/L），100xAA 1ml，搅拌混匀，倒平板（配置100ml灭菌时加入80ml水即可）；

100xAA （每种氨基酸0.5%）配置

准确称取L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸各500g溶于100ml去离子水中，过滤灭菌，4℃保存；

BMGY诱导表达培养基配置

Tryptone 20g/L，yeast 10g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾11.8g/L，加水至890ml，120度灭菌20min，温度下降60℃之后，超净台加入10ml 10xYNB（13.4g/L），1ml的500x生物素（4×10-4g/L），甘油10ml；

BMMY诱导表达培养基配置

Tryptone 20g/L，yeast 10g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾11.8g/L，加水至895ml，120度灭菌20min，温度下降60℃之后，超净台加入10ml 10xYNB（13.4g/L），1ml的500x生物素（4×10-4g/L），甲醇5ml；

500x B（0.02%生物素）配置

生物素20mg/100ml去离子水，过滤灭菌，4℃保存；

10xBasal Salts发酵培养基配置

NH4H2PO4 50g/L，CaSO4 0.93g/L,K2SO4 18.2g/L,MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH3g/L，葡萄糖50g/L,磷酸二氢钾5g/L；

上述培养基YNB，甲醇，生物素，氨基酸过滤除菌，葡萄糖108℃灭菌30min，其余120℃高压灭菌20min；

SDS-PAGE凝胶配置

A液：丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，去离子水搅拌溶解，定容至100ml；

B液：Tris 18.2g，加800ml去离子水，调pH至8.8，加入4ml 10% SDS,定容至100ml；

C液：Tris 6.05g，加30ml的去离子水，调pH至6.8，加入2ml 10% SDS,定容至50ml；

D液：10% SDS

AP：10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

TEMED：TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，低温保存。

不同浓度的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶配置

溶液成分	不同体积的凝胶各成分的体积（ml）
6 %	5	10	15	20	25	30	40	50
水	2.6	5.3	7.9	10.6	13.2	15.9	21.2	26.5
30% A液	1	2	3	4	5	6	8	10
1.5mol/L Tris（pH8.8）	1.3	2.5	3.8	5	6.3	7.5	10	12.5
10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
10% AP	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
TEMED	0.004	0.008	0.012	0.016	0.02	0.024	0.032	0.04
12%
水	1.6	3.3	4.9	6.6	8.2	9.9	13.2	16.5
>30% A液	2	4	6	8	10	12	16	>20
1.5mol/L Tris（pH8.8）	1.3	2.5	3.8	5	6.3	7.5	10	12.5
10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
10% AP	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
TEMED	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
15 %
水	1.1	2.3	3.4	4.6	5.7	6.9	9.2	11.5
30% A液	2.5	5	3.8	5	6.3	7.5	10	12.5
1.5mol/L Tris（pH8.8）	1.3	2.5	3.8	5	6.3	7.5	10	12.5
10% SDS	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
10% AP	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
TEMED	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02

琼脂糖凝胶配置配置

根据要分离的样品（DNA）大小配制合适浓度的琼脂糖凝胶。准确称取一定量的琼脂糖干粉，加入到合适体积的锥形瓶中，加入一定量的电泳缓冲液（30ml左右TAE）；放入到微波炉内加热融化，冷却片刻（不烫手即可）；融化后的琼脂溶液摇晃混匀，倒入电泳槽中，等其凝固；室温下凝固30-40min左右，小心的拔出梳子，取出凝固好的凝胶4℃保存；

蛋白表达常用缓冲液

SDS-PAGE电泳缓冲液配置

配制1L，在1L烧杯中准确称取Tris3.0g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g，，去离子水搅拌溶解，定容至1L；

Western blot转膜缓冲液配置

配制1L，在1L烧杯中准确称取Tris5.8g，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，甲醇200ml，加入去离子水搅拌溶解，定容至1L；

SDS-PAGE上样缓冲液配置

① 5xLoading buffer

配制50ml，在1L的烧杯中，准确称取Tris 0.9g，甘油32.5g，SDS 5g，DTT2.75g，溴酚蓝0.125g，加入适量去离子水搅拌溶解，定容至50ml；

② 2xLoading buffer

配制50ml，在1L的烧杯中，准确称取60mM Tris 0.36g，20%甘油13g，4% SDS 2.0g，150mM DTT 1.10g，

0.1%溴酚蓝0.05g，加入适量去离子水搅拌溶解，定容至50ml；

SDS-PAGE电泳染色液配置

R250（1L）：在合适体积的烧杯中，准确称取R2501.0g，甲醇450ml，乙酸100ml，充分的溶解。

SDS-PAGE电泳脱色液配置

1L：冰乙酸100ml，甲醇100ml，充分混匀，室温放置；

1X PBS pH7.4配置

500ml 1XPBS，在合适体积的烧杯中，准确称取140mM氯化钠4.1g，2.7mM氯化钾0.1g，10mM NaH2PO4·12H2O 1.79g，1.8mM磷酸二氢钾 0.122g，用480左右ml去离子水搅拌溶解，调pH为7.4，定容至500ml；

1xTAE

配置500ml1XTAE ，准备合适体积的烧杯，准确称取Tris 2.42g，乙酸0.571ml，EDTA（Na）0.186g，加入去离子水搅拌溶解，定容至500ml；

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