His标签蛋白上清表达纯化实验流程

第一部分实验材料

1.1实验主要药品和生化试剂

表 1-1主要药品及生化试剂

主要试剂	生产厂家
二硫苏糖醇（DTT）	生工生物工程(上海)股份有限公司（BBI）
苯甲基磺酰氟（PMSF）	BBI
三羟甲基氨基甲烷（Tris）	BBI
乙二胺四乙酸（EDTA）	BBI
氯化钠（NaCl）	BBI
甘油（Glycerol）	BBI
咪唑（Imidazole）	BBI
IPTG	BBI
硫酸卡那霉素	BBI
Trition X-100	BBI
蛋白浓度测定试剂盒	上海碧云天生物技术有限公司
Ni-IDA琼脂糖凝胶	南京德泰生物工程有限公司
SDS-PAGE上样缓冲液	南京德泰生物工程有限公司
SDS-PAGE电泳缓冲液	南京德泰生物工程有限公司
SDS-PAGE预制胶 ECL试剂盒	南京德泰生物工程有限公司
SDS-PAGE Marker和 WB Marker	南京德泰生物工程有限公司

1.2 实验主要仪器

表 1-2 主要仪器

仪器名称	型号	厂家
恒流泵	HL-2	南京大学普阳分析仪器研究所
电子天平	JM-B6002	诸暨市超泽衡器设备有限公司
冷冻干燥机	FD-1A-50	北京博医康实验仪器有限公司
干式恒温器	K30	杭州奥盛仪器有限公司
磁力搅拌器	CJJ-843	金坛市金城国胜实验仪器厂
超净工作台	SW-CJ-ZD	苏州净化设备有限公司
台式全温摇床	QHZ-98A	太仓市华美生化仪器厂
超声细胞破碎仪	XO-1200D	南京先欧仪器制造有限公司
高速冷冻离心机	GL21M	长沙湘智离心机仪器有限公司
四维旋转混合仪	BE-1100	海门市其林贝尔仪器制造有限公司
紫外分光光度计	722S	上海菁华科技仪器有限公司
?KTA蛋白纯化仪	?KTA prime plus	General Electric Company
隔水式恒温培养箱	GNP-9050BS-Ⅲ	上海新苗医疗器械制造有限公司
电热恒温鼓风干燥箱	GZX-GF101-3-BS-Ⅱ	上海跃进医疗器械有限公司
立式压力蒸汽灭菌器	LDZM-80KCS	上海申安医疗器械厂
蛋白凝胶快速处理系统	Pyxis^?	南京思普金生物科技有限公司

第二部分实验方法

2.1 蛋白表达与鉴定

2.1.1 诱导表达及可溶性分析

将构建好的质粒转化到感受态细胞中，然后分别均匀涂布到LB平板上（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素或是100 μg/mL的氨苄青霉素），之后倒置于37℃培养箱过夜。

从转化的平板中挑选单克�。又值�4 mL的LB培养基中（含50 μg/mL的硫酸卡那霉素，个别质粒是100 μg/mL的硫酸卡那霉素），待培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度 0.2 mM IPTG，之后置于15℃、37℃诱导表达。

2.1.2 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果

取诱导后的培养液12000 rpm离心5 min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10 min，然后离心取上清电泳。

全菌采用20 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，20 mM Imidazole含1% Triton X-100，1 mM DTT，1 mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测。

2.1.3 扩大培养

根据电泳结果，选取合适条件扩大培养，挑取单菌落接种子液培养过夜，按千分之一的体积比向摇瓶中加入对应抗性，种子液接种量为1%，37℃培养3-4h至OD₆₀₀为0.6-0.8（若15℃诱导需要提前降温至15℃），加入0.2 mM的IPTG，根据诱导表达结果选择15℃或37℃条件扩大培养，诱导16h后收集菌体。

2.2 蛋白纯化

2.2.1上清中亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）

全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl， 20 mM Imidazole含1% Triton X-100， 1 mM DTT，1 mM PMSF超声裂解，同时以50 mM Tris(pH8.0)，300 mM NaCl，20 mM Imidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用50mM、100mM、500mM浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。

经Ni-IDA亲和层析纯化，收集纯度浓度相对较高的洗脱组分，然后将其透析到PBS， pH7.4中，透析结束后用0.22 μm滤器过滤，并分装冻于-80℃。

第三部分蛋白质检

3.1 蛋白稳定性测试（冻融/复溶实验）

冻融：取一支冻于-80℃的蛋白，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。

复溶：室温下，向蛋白中缓慢加入等体积无菌去离子水重悬，静置5min，无明显浑浊现象且取少量样品离心后无明显沉淀，说明蛋白复溶实验是正常的。

3.2 蛋白浓度测定

测定蛋白浓度采用Bradford/BCA蛋白浓度测定试剂盒。

3.3 蛋白WB检测

WB实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见对应质检报告。

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1.2 实验主要仪器

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2.2 蛋白纯化

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3.2 蛋白浓度测定

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第三部分 蛋白质检

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